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BIOCHEMIE intern

Forschungsthemen: "Wirkungsmodifizierung von Peptidhormonen" und 

"Enzyme & Peptide - Synthese & Modellierung"

Dr. W. Naumann, Dr. A. Lang, Dipl.-Nat. D. Hempelt, Dipl.-Ing..-Pharm. A. Schamberger, DLC A. Schneider

1. Überblick
2. Aktuelle Untersuchungen
3. Analoga des Gonadotropin-Releasing-Hormons
4. Pharmakokinetische Untersuchungen an Peptidkomplexen
5. Strukturuntersuchungen und Modellrechnungen von Peptidkomplexen
6. Themenvorschläge für Master bzw. Bachelorarbeiten und Praktika
7. Workshop "Angewandte Bioinformatik"

Native und synthetische Peptidhormone werden in der Human- und Veterinärmedizin zur Beeinflussung verschiedenster Funktionen des Organismus eingesetzt. Für eine Vielzahl von Indikationen ist die gewünschte Wirkung erst durch eine über Wochen und Monate andauernde Applikation zu erzielen. Die dabei auftretenden Belastungen und Nebenwirkungen für den Patienten können durch den Einsatz wirkungsverlängernder und dosismindernder Depotpräparate wesentlich verringert werden.

Am Institut für Biochemie der TU Dresden konnten für Insulin und D-Phe6-GnRH variable Freisetzungssysteme durch Komplexbildung der Peptidhormone mit metabolisierbaren Komplexpartnern, insbesondere Polyaminosäuren, erzielt werden. Derartige Verbindungen sind als Komplexpartner in ihren Eigenschaften sehr variabel und können so jedem Peptidhormon optimal angepaßt werden. Die Wahl des Komplexpartners entscheidet somit neben den Herstellungsbedingungen über die Freisetzungseigenschaften des Peptidkomplexes.

Von besonderem Interesse ist die Suche nach neuen, wirkungsverbesserten Depotformen mit biophilen Komplexpartnern. Dabei bedeutet die Suche nach den herkömmlichen, weitgehend empirisch ablaufenden Screening-Verfahren einen sehr hohen experimentellen und materiellen Aufwand.

Aus diesem Grund ist es ein Ziel der derzeitigen Untersuchungen der Arbeitsgruppe, geeignete Komplexmodelle durch die Untersuchung der Struktur-Freisetzungsbeziehungen und der pharmakokinetischen Eigenschaften dieser Peptidkomplexe abzuleiten. Diese Arbeiten sollen durch die Entwicklung von Computermodellen mit dem Ziel der Vorhersage von Stärke und Art der Wechselwirkungen in Peptidkomplexen ergänzt werden.

Durch die Kenntnis der molekularen Zusammenhänge von Komplexbildung und -stabilisierung sollen so zielgerichtet potentielle biophile Komplexpartner für die betreffenden Proteohormone abgeleitet bzw. "maßgeschneidert" werden.

GnRH ist ein Dekapeptid folgender Primärstruktur:

Das Hypothalamus-Hormon Gonadotropin-Releasing-Hormon (GnRH) induziert die Freisetzung von luteinisierendem Hormon (LH) und follikel-stimulierendem Hormon (FSH) in den Vorderlappen der Hirnanhangsdrüse. Die Sekretion von LH und FSH, zweier Glykoproteine mit etwa 20% Kohlenhydratanteil, ist ein wichtiger Bestandteil der hormonellen Regulation des Genitalzyklus. Typisch für hypothalamische Freisetzungshormone wie GnRH sind die pulsatorische Sekretion und deren Regulation über einen Feedbackmechanismus.

Vereinfachter Wirkungsmechanismus von GnRH im menschlichen Organismus
(Quelle: Braun, K.; Wirkungsmodifizierung von [D-Phe6]GnRH durch Komplexierung mit Polyaminosäuren und FTIR-spektroskopische Untersuchungen zu Peptidhormon-Polyaminosäurekomplexen, TU Dresden, Dissertation 1991)

Aufgrund der kurzen biologischen Halbwertszeit von nur 2 bis 4 Minuten beim Menschen begann gleich nach der Entdeckung des GnRH im Jahre 1971 durch SCHALLY et. al. die Suche nach hochwirksamen Agonisten und Antagonisten. Das hauptsächliche Ziel bei der Synthese der GnRH-Analoga besteht in der Suche nach Substanzen mit verbesserten pharmakologischen bzw. neuen Wirkeigenschaften, niedriger Histaminfreisetzung und langer biologischer Halbwertszeit. Inzwischen wurden über 5000 derartige GnRH-Analoga hergestellt (Tab. 1).

Tab. 1: Ausgewählte Beispiele für klinisch angewandte GnRH-Analoga

Eingesetzt werden GnRH-Analoga im veterinärmedizinischen Bereich zur Fertilitätssteuerung und Ovulationsinduktion sowie in der Humanmedizin zur Kontrazeption sowie u.a. bei den Indikationen Mamma- bzw. Prostata-Karzinom (Brust- bzw. Vorsteherdrüsenkrebs) und Endometriosis (Entzündung der Gebärmutterschleimhaut).

Der gegenwärtig im Rahmen unserer Untersuchungen eingesetzte GnRH-Antagonist ist das Cetrorelix, eines der wichtigsten Forschungsprojekte der Zentaris GmbH (ehem. ASTA-Medica AG). Im Gegensatz zu den bereits am Markt befindlichen GnRH-Agonisten, die eine Hormonausschüttung erst stimulieren und danach unterdrücken, sind Antagonisten wie Cetrorelix in der Lage, die Rezeptoren sofort zu blockieren und den Hormonspiegel gezielt einzustellen.

Tab. 2: Potentielle therapeutische Anwendungsgebiete für Cetrorelix

Die pharmakologisch wichtigste Eigenschaft der Peptidkomplexe ist ihr Freisetzungsverhalten. Der Komplex soll der gewünschten Kinetik der Hormonfreisetzung möglichst nahe kommen.

Für die Untersuchung des in vitro-Freisetzungs(Liberations-)verhaltens von Peptidkomplexen kommen die üblichen statischen und dynamischen Liberationssysteme zum Einsatz.

Bei der Untersuchung der Struktur von GnRH-Analoga und deren Komplexverbindungen wird von uns das Ziel verfolgt, Informationen über die Bindungsstellen und molekularen Wechselwirkungen zu erhalten, die wesentlich zur Ausbildung und Stabilisierung der schwerlöslichen Komplexe beitragen.

Dabei sind neben den intramolekularen Wechselwirkungen vor allem auch intermolekulare Interaktionen aufzuklären. Folgende wichtige Methoden der Strukturaufklärung können prinzipiell zur Lösung dieser Aufgabe eingesetzt werden:

• Röntgenstrukturanalyse
• Infrarotspektroskopie
• Cirkulardichroismus für flüssige und klare Proben
• Fluoreszenzspektroskopie und UV/VIS-Spektroskopie
• Mehrdimensionale Kernresonanzspektroskopie
• Massenspektroskopie
• Laser-RAMAN-Spektroskopie
• Gelelektrophorese

Um ein vollständiges Bild der Peptidstruktur zu gewinnen, müssen in der Regel mehrere dieser analytischen Methoden eingesetzt werden, da die Betrachtung einzelner Substanzeigenschaften für sichere Strukturaussagen meist nicht ausreicht.

Durch die Arbeitsgruppe selbst werden vorrangig spektroskopische sowie elektrophoretische Untersuchungen durchgeführt.

Typische IR-Spektren von Proteinen mit Amid A-, Amid I- und Amid II-Banden (Alpha-Keratin)

Für die Erarbeitung von Computermodellen kommen in erster Linie Kraftfeldverfahren, wie CHARMM und UNIVERSAL zum Einsatz, die sich für Berechnungen an Polypeptiden besonders gut eignen. Mit Hilfe quantenchemischer Verfahren werden vor den Kraftfeldrechnungen die partiellen Atomladungen bestimmt. Schwerpunkte der Modellierungen bilden Konformationsanalysen sowie Docking-Studien mit verschiedenen Komplexpartnern.

Aus allen nachfolgenden Themen lassen sich auch Teilaufgaben für Bachelorarbeiten ableiten!

Sekundärstrukturuntersuchungen an Peptiden und enzymatische Synthesen: 

Thema 1: Verifizierung einer gerätespezifischen FTIR – ATR -  Proteindatenbank mit Modellpeptiden

Thema 2: Testung und Optimierung einer FTIR – Proteindatenbank  zur Sekundärstrukturvorhersage von Peptiden

Interaktionen an Pilzmyzelen:

Thema 1: Untersuchungen zum Wachstumsverhalten von ausgewählten Pilzmyzelen in edelmetallhaltigen Nährlösungen 

Thema 2: Überprüfung der Stabilität von Nanopartikeln in ausgewählten Nährmedien für Pilzkulturen

Thema 3: Optimierung der FTIR - ATR – Präparationstechnik zur Untersuchung von Pilzproben 

Entwicklung neuer Peptidwirkstoff - Komplexe mit vorrangig Depoteigenschaften insbesondere für die Tumorbehandlung.

Thema 1: Untersuchungen zum Komplexierungsverhalten von Cetrorelix und anderen GnRH - Antagonisten mit ausgewählten Chitosanfraktionen

Thema 2: Untersuchungen zur Gewinnung und Optimierung von Chitosan – Sandwich - Komplexen mit Cetrorelix und anderen Modellpeptiden

Thema 3: Untersuchungen zum Liberations- und Depotverhalten von Chitosankomplexen mit GnRH-Anatgonisten

Thema 4: Fluoreszenzspektroskopische Bestimmung thermodynamischer Profile der Komplexierungs- und Aggregationsvorgänge von GnRH - Anatgonisten

Weitere Themen:

DSC- und ITC - Untersuchungen  von Peptidhormonkomplexen und Aggregaten

Im Rahmen einer Diplom/Masterarbeit ist zu untersuchen, inwieweit mit Hilfe der Differential Scanning Calorimetry und der Isothermen Titrations Calorimetrie  strukturelle Veränderungen bei der Komplexierung von Analoga des Peptidhormons GnRH mit verschiedenen Komplexpartnern nachgewiesen werden können. Weiterführend soll neben der qualitativen Aussage zum Komplexierungsprozess eine Quantifizierung zur Evaluierung der Komplexpartner und der Ergebnisse des Molecular Modelings angestrebt werden.

Bisherige Ergebnisse der Untersuchungen zur Charakterisierung des Verhaltens von Peptidhormonen in wässrigen Lösungen nutzend ist im Rahmen einer Diplomarbeit der Vorgang der Komplexierung mit ausgewählten Partnern aufzuklären. Dabei soll der Komplexierungsvorgang mit Hilfe von MALDI - oder ESI - TOF - MS-Messungen näher analysiert und der Komplex selbst fassbar werden. Ein besonderer Schwerpunkt ist die Entwicklung einer geeigneten MS - Probenpräparationstechnik, die eine  Veränderung  bzw.  Zerstörung der empfindlichen Komplexstrukturen vor dem eigentlichen Messprozess verhindert.

Als Beitrag zur Aufklärung der Beziehungen zwischen Struktur und Freisetzungseigenschaften von Peptidhormonkomplexen sind Komplexe mit ausgewählten biophilen Komplexpartnern zu präparieren. Die Charakterisierung der Peptidhormonkomplexe soll durch pharmakokinetische Untersuchungen (statische und dynamische Liberation) sowie durch Strukturuntersuchungen mit Hilfe der FTIR - Spektroskopie erfolgen.

Ausgehend von den bisherigen fluoreszenzspektroskopischen Untersuchungen zum strukturellen Verhalten von Peptidhormonen in wässrigen Lösungen ist im Rahmen einer Diplomarbeit der Vorgang der Komplexierung mit ausgewählten Partnern zu analysieren. Dabei soll die intrinsische Fluoreszenz der Peptide und/oder Partner genutzt werden, um den molekularen Verlauf des Komplexierungsvorganges und die daran beteiligten strukturellen Bereiche der Peptidoberfläche zu erfassen.

Im Rahmen der Diplomarbeit ist zu untersuchen, inwieweit mit den Methoden der Elektrophorese die chemische Natur der Komplexe von Analoga des Peptidhormons GnRH mit verschiedenen Partnern aufgeklärt werden kann. Dabei stellt die geringe Stabilität dieser Komplexe unter chromatographischen und elektrophoretischen Bedingungen eine ganz besondere Herausforderung. Auf bisherigen Ergebnissen aufbauend soll die Methodik universell für ein weites Spektrum von Komplexpartnern etabliert  werden. Es sind sowohl die gerätetechnischen Vorrausetzungen zu erarbeiten, als auch geeignete Trägermaterialien und Trennbedingungen aufzufinden, die eine nichtdestruktive Untersuchung der genannten Komplexe ermöglichen.

Unter Nutzung des institutseigenen Linux -Clusters sind Computersimulationen durchzuführen, die die Interaktion von Peptidhormonen und Partnermolekülen abbilden. Komplexstabilisierung und spezifische Wechselwirkungen zwischen Peptid und Partner sind zu analysieren. Ein Übergang von der Reproduktion experimenteller Ergebnisse zur Prädiktion selbiger ist anzustreben. Zur Bearbeitung dieser Problemstellung sind Vorkenntnisse von UNIX/Linux und Tcl vorteilhaft (aber nicht Bedingung). Erfahrungen im Umgang mit Methoden des Molecular Modelings sind nicht zwingend erforderlich.

Alle genannten Themen können nach Abschluss der Masterarbeit im Rahmen einer Dissertation ausgebaut und fortgeführt werden.

Für Interessenten und für weitere Informationen:

Dr. W. Naumann
Neubau - Chemische Institute  Raum 335
e-mail: wolfgang.naumann@chemie.tu-dresden.de
Tel.: (0351) 463 34631
Fax: (0351) 463 34631